鸡真皮黑色素抑制基因精细定位及相关质量性状分子标记鉴定研究

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随着人们对畜禽产品的要求不断提高,优质鸡的生产成为畜禽产业工作者的重点目标之一。优质鸡除了要求肉品质本身营养物质含量,风味物质以及口感等方面的要求,另外还需要具备特有的包装性状。质量性状将成为地方优质鸡的天然标识,能够起到防伪标识的作用。对于家禽来说,与色素相关的质量性状有胫色和肤色等。为了建立优质鸡育种黑色素相关性状的分子标记辅助选择技术(MAS),本文基于集群分离分析法利用目标区域捕获测序技术对鸡真皮黑色素抑制基因进行定位,并对鸡青胫和乌肤性状进行了分子标记鉴定和位点的多态性分析,建立了分子标记辅助选择体系。本研究获得以下主要研究结果:试验一目标区域捕获测序技术定位鸡真皮黑色素抑制基因利用固始鸡-安卡鸡F2资源群体,建立胫色表型极端DNA混池——黄胫DNA混池和青胫DNA混池,采用目标序列捕获测序技术,以Chr Z 67.1-72.3 Mb为核心区域的10 Mb区间,对黄胫DNA混池和青胫DNA混池,分别进行了200×深度测序。对青胫DNA混池和黄胫DNA混池进行测序得到的SNP等突变位点进行SHOREmap分析和差异位点分析,定位鸡真皮黑色素抑制基因的区间位于鸡Z染色体的71.58-72.18 Mb,缩小了鸡真皮黑色素抑制基因的区间,为青胫基因的定位和胫色性状原因突变的确定奠定了基础。试验二鸡真皮黑色素抑制基因候选基因的确定在差异位点分析得到的31个纯合突变位点中,选择6个突变位点(位于外显子,内含子,基因调控区域及其附近),分别命名为位点Ⅰ-Ⅵ,在F2资源群、不同胫色的鸡种(固始鸡、丝羽乌骨鸡、海赛克斯A系)和丝毛乌骨鸡与海赛克斯A系的杂交F1代中进行基因分型,对基因型与胫色性状进行关联分析,发现Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ三个位点与胫色性状显著关联。这三个位点在染色体上的位置所处的区域,分别为CDKN2A基因的内含子、CDKN2B基因的上游、基因间区。据此,参考基因分型的特点,开发位点Ⅳ为判定鸡青胫位点基因型的分子标记。对鸡青胫基因的位置候选基因(MTAP、CDKN2A和CDKN2B),分析其在不同胫色鸡的胫肤组织中的表达量,并对突变位点进行生物信息学分析。根据连锁分析,组织表达量分析和生物信息学分析结果,我们认为CDKN2A/B基因是鸡真皮黑色素抑制基因的候选基因。试验三鸡乌肤性状的原因突变的验证及分子标记开发根据本课题组前期对中国地方鸡拷贝数变异研究的结果,发现丝羽乌骨鸡和淅川乌骨鸡共同存在的一个拷贝数变异CNVR—Chr20的10,717,668–10,845,246 bp和11,265,289–11,435,353 bp两处。利用qPCR技术对aCGH芯片测定拷贝数变异的结果进行了验证,结果发现丝羽乌骨鸡在Fm位点的拷贝数约为2,而淅川乌骨鸡在Fm位点的拷贝数在1.5-2之间。为了探索该位点在丝羽乌骨鸡和淅川乌骨鸡中的差异,我们扩大验证群体后发现了相同的结果。为了建立Fm位点基因型的判定方法,进一步利用qPCR对丝羽乌骨鸡与海赛克斯A系的正反交F1代个体进行了Fm位点的拷贝数研究。结果发现:以fmfm基因型个体在Fm位点的拷贝数为1,则Fmfm基因型个体在Fm位点的相对拷贝数约为1.5,FmFm基因型个体在Fm位点的相对拷贝数约为2。这一分子标记和基因型判定方法将可以用于鸡乌肤位点纯合子的鉴定,为鸡乌肤性状的分子标记辅助选择育种提供了依据。综上所述,本研究将鸡真皮黑色素抑制基因精细定位在鸡Z染色体的71.58-72.18 Mb之间,并找出了鸡真皮黑色素抑制基因可能的候选基因——CDKN2A/B,缩小了鸡真皮黑色素抑制基因的定位区间,为揭示胫色的形成机制奠定理论基础;开发了与鸡青胫性状性状连锁的分子标记,开发了乌肤位点基因型判定的分子标记;为与黑色素相关的质量性状——青胫和乌肤的分子标记辅助选择育种提供依据和思路。
致谢第5-9页
Abstract第9-10页
摘要第12-14页
1 文献综述第14-36页
    1.1 鸡黑色素相关的质量性状的基因定位研究进展第14-18页
        1.1.1 鸡胫色性状的定位第14-15页
        1.1.2 肤色性状的定位第15-17页
        1.1.3 白羽性状的定位第17-18页
    1.2 黑色素的研究进展第18-23页
        1.2.1 黑色素细胞的起源、分化与形成第19-21页
        1.2.2 黑色素的产生、运输及沉积第21-23页
    1.3 集群分离分析法第23-26页
        1.3.1 集群分离分析法的原理和方法第23-24页
        1.3.2 集群分离分析法的应用第24-25页
        1.3.3 构建DNA混池的注意事项第25-26页
    1.4 新一代测序技术第26-29页
        1.4.1 新一代测序技术的原理第26-27页
        1.4.2 目标序列捕获第27-28页
        1.4.3 目标序列捕获测序技术的应用第28-29页
    1.5 拷贝数变异及其检测方法第29-34页
        1.5.1 家禽拷贝数变异的研究进展第29-30页
        1.5.2 拷贝数变异的检测方法第30-34页
    1.6 分子标记及其研究方法第34-36页
        1.6.1 分子标记的发展第34页
        1.6.2 单核苷酸多态性第34-36页
2 引言第36-38页
    2.1 鸡质量性状研究的重要性.第36页
    2.2 本研究的目的、意义及主要研究内容第36-38页
3 目标区域捕获测序技术定位鸡真皮黑色素抑制基因第38-59页
    3.1 材料与方法第39-44页
        3.1.1 试验样品采集和DNA混池的构建第39页
        3.1.2 目标区域捕获试剂盒的定制第39-40页
        3.1.3 混池文库的构建第40页
        3.1.4 目标区域捕获测序第40-41页
        3.1.5 测序数据的处理第41页
        3.1.6 定位鸡真皮黑色素抑制基因第41-44页
    3.2 结果与分析第44-55页
        3.2.1 混池文库的构建第44-45页
        3.2.2 捕获测序结果第45-46页
        3.2.3 测序数据的Mapping第46-48页
        3.2.4 测序结果的SNV和In Del分析第48页
        3.2.5 SHOREmap分析第48-51页
        3.2.6 青胫DNA混池和白胫DNA混池的差异位点筛选与分析第51-53页
        3.2.7 不同胫色混池的基因型频率和基因型频率比值第53-55页
    3.3 结论与讨论第55-57页
        3.3.1 基于集群分离分析法构建F2极端表型混池第55-56页
        3.3.2 目标区域捕获测序定位基因第56页
        3.3.3 基因型频率和基因型频率比值第56-57页
    3.4 本章小结第57-59页
4 鸡真皮黑色素抑制基因的候选基因确定第59-81页
    4.1 材料与方法第60-67页
        4.1.1 试验动物第60页
        4.1.2 试验方法第60-67页
    4.2 结果与分析第67-77页
        4.2.1 鸡真皮黑色素抑制基因的位置候选基因第67页
        4.2.2 差异位点的基因分型第67-70页
        4.2.3 差异位点基因型与胫色的关联分析第70-74页
        4.2.4 鸡胫色性状的分子标记第74页
        4.2.5 位置候选基因的生物信息学分析第74-76页
        4.2.6 位置候选基因的组织表达分析第76-77页
    4.3 结论与讨论第77-80页
    4.4 本章小结第80-81页
5 鸡乌肤性状原因突变的验证与分子标记开发第81-92页
    5.1 材料与方法第82-85页
        5.1.1 试验动物及样品采集第82页
        5.1.2 试验方法第82-84页
        5.1.3 试验数据的处理第84-85页
    5.2 结果与分析第85-88页
        5.2.1 标准曲线的制作第85页
        5.2.2 不同肤色的鸡种在EDN3位点的相对拷贝数第85-87页
        5.2.3 丝羽乌骨鸡与淅川乌骨鸡在EDN3位点的相对拷贝数第87页
        5.2.4 不同基因型个体在EDN3位点的相对拷贝数第87-88页
    5.3 结论与讨论第88-91页
    5.4 本章小结第91-92页
6 全文结论、需进一步研究的内容及创新点第92-94页
    6.1 全文结论第92页
    6.2 需要进一步开展的工作第92页
    6.3 创新点第92-94页
参考文献第94-104页
附录第104-106页
作者简介第106-107页
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论文编号ABS4317163,这篇论文共107页
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